关键词：铝；儿茶酚类；形态分析；示差脉冲伏安法；人体液
中图分类号：O657.1 文献标识码：A
一、前言
微量元素在生物体中的作用，尤其是对人体健康的影响是当前生物学、医学和化学科研工作者研究的热门交叉课题[1~7]。铝被公认对人体具有毒性，其致毒机理虽然还不清楚，但是大量的证据表明铝与某些疾病相关联，比如阿尔滋海默氏症、帕金森氏症、糖尿病、癌症等[3,6]。然而铝的生物有效性和毒性依赖于它在溶液中的形态分布[3,4,8]。在各种铝存在形态中，正电荷的水合铝离子（[Al(H2O)6]3+），羟基铝（[Al(OH)(H2O)5]2+，[Al(OH)2(H2O)4]+等）被认为最具毒性，而有机结合态的铝一般被认为是无毒的形态[7-15]。人体中吸收的铝是通过血液传输的。血清是一个十分复杂的混合物，它的组成包括脂类(脂蛋白)、蛋白质（例如免疫球蛋白、白蛋白和铁转移蛋白）、小分子，还有一些离子等等[11]。已经有文献报道铝在血清中的主要形态是Al-去铁胺和Al－铁蛋白[8,9]。其它诸如白蛋白的可能结合铝的大分子量(HMM)的蛋白质，被认为是非常弱的金属离子配位体，不足以竞争结合一定数量的铝[16,17]。对于小分子量(LMM)的配体来说，柠檬酸和磷酸是最重要的。氨基酸、乳酸、草酸，及其它无机阴离子都竞争不过柠檬酸与磷酸[16]。
因此，研究铝在人体中的结合形态、对其生理作用，对人类健康的影响和采取有效的预防措施来保护人类健康及开发相应的治疗药物具有重要意义。
铝离子形态分析方法可以被分为四类[18]：（1）基于化学模型的热力学平衡计算。（2）基于分析试剂与各种铝形态的反应动力学的差异进行分离分析。（3）直接光谱测定技术，如核磁共振（NMR）。最广泛应用的是27Al-NMR。（4）联用技术，先是进行有效的分离（超滤、渗析），接着光谱测定。近十年来，此法在生物体液铝形态分析中占据了重要地位。但是，谱学技术的仪器昂贵，形态分析操作过程繁杂，易引入污染物，核磁共振的灵敏度较低，不能应用于实际样品的分析中，而超滤、渗析则因操作问题会带来较大误差。近年来，电化学方法由于灵敏度高、操作方便和仪器便宜等优点被广泛应用于铝的形态分析[3,4]。我们实验室采用一系列试剂用于电化学Al形态区分，并与经典的Driscoll方法比较，获得了满意的结果[8-14]。研究中我们发现，在酸性条件下，选择适当试剂可以在pH4~5酸性区间测定无机单核铝，此时绝大部分无机单核铝组分均被分析试剂夺取，但是，有机结合铝形态仍然很稳定，能够抵抗来自分析试剂的竞争配位。而在pH8~9碱性条件下，分析试剂具有足够强的配位能力，不仅能从无机单核铝，而且可以从几乎所有有机结合态铝中把铝夺取出来，从而测定总单核铝。再用ICP测定总铝，减去单核铝浓度可以获得聚合多核铝浓度，由此进行天然水体和体液中铝形态区分[13,14]。
我们选择了维生素B6(VB6)来测定铝，它们的化学结构见图1。VB6其化学成分为盐酸吡哆醇，是一种常见的营养药。VB6在体内参与氨基酸代谢、促进氨基酸的吸收和蛋白质的合成、参与血红素的合成等。VB6在临床上也有许多用途。通过实验发现铝与VB6会发生配位，这样抑制了它们的氧化。这就是VB6电化学方法测定铝的理论基础，由此建立了VB6示差脉冲伏安法，对生物样品中的铝形态分析进行了分析，并与超滤、渗析等方法进行了比较，结果令人满意。与其它形态分析技术相比，电化学具有高灵敏度、仪器便宜、操作简单和测定快速等优点。
二、实验部分
1、仪器
三电极系统：玻碳电极为工作电极，铂片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。分析测定在美国BAS公司的BAS-100电分析仪上进行。示差脉冲伏安参数为：扫速20mV/s，脉冲幅度50mV，脉冲宽度60ms。79-1型磁力加热搅拌器（国华仪器厂）。PXD-12型数字式离子计（江苏电分析仪器厂）。超滤装置是Amicon公司的Stirred Ultrafiltration Cells (Model 8200)，超滤膜的截留分子量为10000。透析袋的截留分子量为10000。处理方法为在2%的NaHCO3，10-2M的Na2EDTA溶液中煮沸10min，清洗，再用去离子水煮沸[16]。
2、试剂
7.6×10-3M的维生素B6（99%，瑞士Acros Organics公司）储备液， 0.02M的铝储备液由高纯铝粉溶于适量浓盐酸，稀释成100ml，使用时再稀释。缓冲溶液：pH3.6~5.4由NaAc和HAc按适当比例配制，pH7.8~9.2由NH4Cl和NH3·H2O按适当比例配制。支持电解质为0.15MNaCl。实际样品包括血清（南京红十字血液中心提供）和脑脊液（中大医院提供）。所用化学试剂除特别说明外均为分析纯。实验器皿使用前在1:10硝酸浸泡24h后再用自来水、蒸馏水和二次蒸馏水依次洗净。实验用水为二次蒸馏水。
3、实验步骤
用细砂纸湿磨抛光玻碳电极，再用湿吸水纸轻擦，然后分别在0.1 M盐酸溶液和蒸馏水中超声洗涤5min。在-0.30到1.00V以100mV/s的速度扫循环伏安图，直到电流处于稳定状态。实验时，将50 ml试液置于三电极系统，记录试剂示差脉冲氧化峰电流，以100 mV/s线性扫描反扫清洗电极。每注射一次铝溶液电磁搅拌5min，静置1 min后记录示差脉冲氧化峰电流。在N2气氛保护下实验。
平衡透析是装有5ml血清的透析袋悬浮在装有495ml二次蒸馏水的烧杯中24h，并且溶液被搅拌以加快平衡时间，然后用ICP-AES检测铝浓度。
三、结果与讨论
1、测定溶液中铝浓度方法的建立
（1）VB6的DPV图
图2为VB6分别在酸性和碱性两个pH条件下无铝和有铝时的DPV响应图。在研究电位区间，底液的电化学响应是较平坦的曲线。加入VB6试剂后，出现一DPV氧化峰，碱性时的峰电位均比酸性时的峰电位负。加入铝后，峰电位不变，峰电流下降，且峰电流随加入铝浓度的增加呈线性下降。这是本方法的实验基础。
（2）测定条件的优化
铝形态的分布及铝-VB6配合物的形成与pH值的变化都有很大的关系。因此，pH值是测定铝的一个非常重要的因素。pH值的影响见图3（a,b）。从图中可以看出，ΔIp在酸性和碱性区间的现象相同，先是随pH增大而增加，然后分别在pH4.6、8.5处达到最大值，而后随pH继续增大而减小。VB6的浓度往往与测定的线性范围及检测限有很大关系。缓冲液的浓度也会影响测定的灵敏度。图3(c,d)，(e,f)分别显示了这两种因素的影响。实验条件优化的结果在表1中列出。
2、线性范围、检测下限和相对标准偏差
在上述最佳测定条件下，对线性范围、检测限和相对标准偏差分别进行了测定（见表2）。
3、体液中铝形态分析
（1）SPE模拟计算的结果
采用SPE程序[17]对血清模型计算铝形态分布，我们只考虑小分子量配体，忽略大分子量配体。由前人的工作得知，柠檬酸、磷酸是铝的最主要的小分子量配体，故血液模型中只加入了这两种物质。平衡常数来自文献[17]，见表3。选取VB6加入到模拟血液的体系中来进行计算。忽略了可能存在的混配情况，以及离子强度对形态分布的影响，结果见图4。其中纵坐标代表物种浓度占总铝浓度的百分数。从中我们可以看出，pH=4.0~5.0时，Al3+-柠檬酸根配合物占总铝浓度的大部分。PH=8.5时，VB6从柠檬酸配合物和四羟基铝离子中几乎夺取了全部的铝离子，形成1:3的配合物。这就从热力学上证明了VB6可用来进行对血液中铝形态区分。
（2）实际体液中的铝形态测定
血清的成分种类很复杂，在测定铝之前，我们先选择了一系列相关的生物小分子和离子做干扰实验。酸性条件下，主要干扰为Fe3+、Fe2+、Mn2+、Cu2+（1~5倍）。然而体液中大部分阳离子自由态浓度远低于铝浓度，Fe、Mn、Cu主要处于配位状态，这将减轻它们的干扰。例如，在生理pH自由态的铁浓度比铝的自由态浓度低七个数量级[11]，大量的铁被铁蛋白和铁转移蛋白结合[2]。其它无机离子的干扰情况为：Pb2+(10~20倍)，Ca2+和Mg2+（100~200倍），Ni2+、Li+和PO43-（200~500倍），F-(1000倍)，这些离子在体液中的浓度远低于干扰临界值，对本文铝形态分析无干扰。大量的Na+、K+、NH4+、 NO3-、Cl-不干扰。有机物质的干扰情况为：EDTA、脲酸、磺基水杨酸、半胱氨酸（5~10倍），精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸（50~100倍），抗坏血酸、柠檬酸、脲素、琥珀酸、谷氨酸（200~500倍），草酸、葡萄糖、酒石酸、乳酸(>1000倍)。碱性条件下，阳离子的干扰变化不大，有机物质的干扰则明显减轻。EDTA、脲酸、磺基水杨酸、半胱氨酸（20~50倍），精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸（200~500倍），抗坏血酸、柠檬酸、脲素、琥珀酸、谷氨酸(>1000倍)。
为什么不同pH条件下，各种配体的干扰倍数会又如此大的差异？问题的答案在于铝－VB6配合物同铝柠檬酸根配合物的稳定常数对pH的不同依赖关系造成的。在酸性条件下，有机配体表现出比VB6更强的配位结合能力。因此VB6只能夺取自由铝，羟基铝、硫酸根、硅酸根以及氟离子的配合物以及一小部分不稳定有机配合物中的铝离子。但是，在碱性条件下，VB6具有比柠檬酸等配体更强的配位能力。因此，VB6不仅能夺取无机单核铝，而且也可以从有机结合态铝中把铝夺取出来，在这样的条件下，测定的铝形态是总单核铝组分。这也从另一方面验证了我们的两个pH条件下铝形态区分思想。
用VB6分别在酸性和碱性条件下，对五个健康人的血清进行了铝的测定，并同超滤、渗析方法进行了比较，结果见表4。
血清是一个复杂的混合物，包括脂类、蛋白质、小分子和一些无机离子等，但其中铝的真正有效配体并不多。大分子量的主要是铁转移蛋白，并且可能是唯一结合铝的蛋白质。它结合了血清中绝大部分的铝，大约占总铝的80%~90%[13，14]。在小分子量的配体中，柠檬酸和磷酸占据了主要地位，两者结合了大约总铝的10%~20%。VB6法在碱性条件下测的是总单核铝，酸性条件下测的是无机单核铝。也就是说，碱性条件下测定的铝对应的是小分子量配体结合的铝。从表4中可以看出，测定的总单核铝占总铝的大约15%左右，与前人工作的结果基本吻合[2,18]。
同时，这部分结果还与超滤、渗析的结果进行了比较。在血清铝形态的分析方法中，超滤、渗析也占据了一定地位。超滤、渗析是运用物理的手段，利用配体之间的分子量差别对铝形态进行粗分，形成了high molecular weight(HMW)和low molecular weight(LMW)两部分。由于血清中大分子配体与小分子配体之间的分子量差别较大，故文献报道的结果也比较一致，LMW占据了总铝的10%~20%[2]，与用其他方法得到的结果吻合。从表4中可以看出，我们做的超滤与渗析的结果比较接近，均占总铝的15%~20%，与文献报道值一致[2,9]。六种试剂测定的总单核铝与之比较，结果吻合。这也说明了VB6可以用电化学的方法对血清中的铝形态进行粗分。
对于小分子量的配体，是柠檬酸占据主要地位，还是磷酸结合了大部分的铝，存在两种观点。Ohman[20]等人认为柠檬酸是唯一的小分子量配体。Kiss[17]的工作则表明两者在小分子量配体的部分中都有贡献。我们测定的无机单核铝变化较大，占总铝的5%~15%。这个结果符合Polak[19]的观点，他认为这部分的铝形态随着不同的个体变化较大。我们还对脑脊液中的铝进行了测定，结果见表4。由于铁转移蛋白在脑脊液中的浓度非常的低[8]，因此Al-铁转移蛋白配合物在脑脊液中不存在，这一点与血清中的情况不同。碱性条件下我们得到的结果与ICP-AES的结果基本一致。这说明脑脊液中没有含有什么强的配体。
四、结论
铝的化学形态与它的生物效应密切相关。在本文中，我们建立了一种新型的利用VB6作为电化学配体间接对铝进行形态区分的方法，并且将之成功的应用于体液中Al形态，区分原理是基于VB6和有机配体在不同的pH条件下对铝离子不同的配位竞争能力。在碱性的条件下，从热力学和动力学的角度有利于Al-VB6配合物的形成，可以测定总单核铝。而在酸性的条件下，有机配体，如柠檬酸根，体现出对铝离子更强的配位能力，结果测定的是无机单核铝部分。该法开拓了一种新的对体液中铝形态区分的思想。本法采用VB6作为测定配体，VB6作为营养药，具有很好的生物相容性。本法进一步的改进成熟，对其机理进一步的量化考察，可以更好的发展成为一种灵敏的形态区分手段，并且结合微电极技术，也许能够实现对活体进行铝形态分析测定。
